第 69 期 2004-10-20

研究發展
強化惡性腫瘤細胞穿透力量測機制

癌症 (惡性腫瘤) 的發生大多是因為細胞長期受到外來致癌因子的刺激，加上先天性與後天性基因突變，導致細胞週期失控進而迅速分裂增殖。一般而言，腫瘤細胞增生到約109 個細胞數目時，病人方才出現明顯臨床症狀而主動就醫。然而，不幸的是，此時病患體內的腫瘤細胞多已發生向週邊正常組織擴散、侵襲、甚至轉移到遠端器官的惡性現象。此名之為「癌轉移」 (metastasis) 的癌細胞移動現象，是當前認為奪去許多病患寶貴生命的最主要原因。換言之，現今治療惡性腫瘤最困難的地方，除了其無法被早期偵測發現外，對於臨床上如何阻斷後續癌細胞的侵襲與轉移，仍缺乏有效且副作用低的治療方法。

經研究已知，當惡性腫瘤開始要轉移時，第一個步驟就是進行癌細胞的侵襲動作；其特點在於癌細胞會先破壞鄰近正常組織中，負責支持細胞構型的細胞外間質 (extracellular matrix) 以及基底膜 (basement membrane) 等生物屏障，進而促使癌細胞進入淋巴或血液循環系統，以達成後續轉移到它處組織器官之目的。而為研究此生理現象，癌症學家們除了嘗試以動物譬如老鼠作為活體內 (in vivo) 實驗對象外，更希望能發展出一套技術簡便且較不受爭議的活體外 (in vitro) 癌侵襲模擬實驗系統。於是，各種生物組織材料例如人類胎盤羊膜、雞胚胎尿囊膜、大鼠膀胱、甚至是狗或牛的大血管以及牛眼的水晶體等，都曾在早期被科學家們用來取代癌侵襲相關實驗所需之細胞外間質與基底膜。然而，利用這些不同替代品的共同缺點，在於其實驗操作上極為耗時耗力且所費不貲。更甚者，因為這些動物組織的結構與厚薄程度各不相同，致使惡性腫瘤細胞對於穿透這些替代物的能力互異，進一步造成不同實驗室間所得到的研究數據相差過大，而影響了最終實驗結果的再現性與準確度。1982年，在當時仍普遍缺乏著良好的癌侵襲模擬實驗材質，美國國家口腔醫學研究院 Hynda Kleinman 博士所率領的研究團隊，成功地依據從小鼠EHS 肉瘤中所分離出來的基底膜成分，設計了一套名為「重組基底膜」的替代用品。此重組基底膜包含了許多細胞外間質的主要成分例如第四型膠原蛋白 (collagen IV) 、基膜素 (laminin) 以及內動素 (entactin) 等。其優點在於成分的種類與組合比例與實際活體中的基底膜非常類似，但缺點則是其中的第四型膠原蛋白極難溶於水。數年後，美商必帝股份有限公司 (Becton, Dickinson and Company) 針對此重組基底膜作進一步的改良，除解決了原先第四型膠原蛋白難溶於水的問題，更大舉將此重組基底膜商品化並推廣銷售。

除了解決關鍵性的實驗材質難題外，對於一套成功的活體外癌侵襲模擬實驗系統，尚需搭配著良好的操作平台。1962年，澳洲坎培拉大學Stephen Boyden 博士率先發明了一套後人稱之為Boyden chamber的小型儀器。Boyden 博士為了研究動物細胞經由微生物或化學物質刺激後，所表現出正趨向或負背離的「細胞趨性」現象，而設計了一個含上下兩層孔洞的chamber。其實驗設計理念是先將細胞培養液注入chamber的下層孔洞，並以濾紙將chamber的上下兩層作一區隔後，再置放測試細胞於上層孔洞觀察其細胞趨性與移動情形。二十三年後，也就是1985年，美國Roswell Park Memorial研究所的Helena Gabor 博士與Leonard Weiss醫師二人採用一種含孔徑大小為8?12 mm、密度為每平方公分十萬個小孔的疏水性聚碳酸酯膜 (polycarbonate membrane) 為材質，以研究惡性腫瘤細胞在穿透膜上小孔過程中的型態改變。隔年，美國國家口腔醫學研究院Victor Glushko 博士所率領的研究團隊，進一步利用聚碳酸酯膜當基底，將前述之「重組基底膜」均勻塗抹於其上，並置入Boyden chamber中藉以觀察癌細胞的侵襲現象。此實驗技術的優點是基底膜厚薄均勻，而且聚碳酸酯膜不僅提供基底膜一個附著介面，其上的孔洞更可以讓癌細胞輕易穿透，間接使得操作人員在判讀癌細胞的侵襲能力時能更為準確方便。大約同時間，美國亞歷桑那大學 Mary Hendrix 博士 (其為本院企劃考核組朱伊文主任的博士論文指導教授) 等人針對 Boyden chamber 作大幅度的改良。除了將孔洞數目一口氣增加至12個以外，更將此集眾家精華的癌侵襲模擬系統正式命名為Membrane Invasion Culture System (MICS)，並在短時間內贏得許多癌症研究學者專家們的好評。

綜觀整個活體外癌侵襲分析實驗的發展史，最主要的技術突破在於發展出可以貼切模擬人體內組織器官的細胞外間質與基底膜材質。從早期直接利用動物組織或人類胎盤羊膜為替代品開始，到後來「重組基底膜」的誕生，科學家們終於得以克服長久以來基底膜的取得不易與厚度不均等困難。這樣的發明不但使得不同實驗室間的研究數據終能放在同一套標準下作一比較，也使得研究結果的再現性相對提高許多。而疏水性聚碳酸酯膜的問世，更是提供了重組基底膜一個絕佳的支撐平面。研究結果顯示，甚至在沒有塗佈基底膜的情況下，單單是聚碳酸酯膜本身，即可被用來作為測量細胞移動與穿透力的分析實驗。至於chamber的設計，從早期僅用單一孔洞來觀察細胞趨性的 Boyden chamber，中期的12孔洞MICS 系統，一直到最近幾年來所開發之高效能多孔洞癌侵襲模擬實驗分析儀等，都對於癌轉移的技術研發有著極大的貢獻。大致而言，Boyden chamber最大的優點在於售價最便宜，但缺點則是一個 chamber內只含一個孔洞；且不同chamber 間所塗佈的基底膜厚薄度不容易達成一致，因此較適合小型實驗室分析細胞趨性反應之用途。至於BioCoat™ FluoroBlok™ Invasion System 與 QCM™ 96-Well Cell Invasion Assay 等生技產品，其優點是基底膜厚度均勻一致、實驗操作簡單且可單次篩選多個樣品數，但缺點則是造價太高，而且chamber一旦拆封就必須使用完畢，倘若實驗上僅需使用三、五個孔洞，其它空餘的孔洞也不得不於實驗後一併做廢丟棄，因此這二套系統較適合中大型實驗室分析大量癌侵襲相關基因或化合物之研究目的。至於 MICS 的優缺點則介於上述產品之間，其費用較為便宜且不需其它儀器支援，但耗時耗力與誤差值偏大的缺點依然存在。

有鑑於此，院長實驗室吳成文院長以及張文祥助研究員所率領的研究團隊，特針對目前市面上活體外癌侵襲模擬實驗系統的幾個常見缺點做徹底改良，此研究團隊除設計一個可回收重複使用之24孔洞低價位chamber外，更運用加長與加寬細胞收集孔以及水平氣孔的方式，將原本上下層尺寸大小完全一致的chamber更改成「上小下大」的梯狀chamber。經實驗結果證實，此操作系統無論是在實驗流程的精簡、技術操作的穩定性、孔數與裝置重量比、以及實驗數據的可信度方面，皆有非常顯著的改善。此系統不但可以大為降低實驗成本至少 達百分之六十以上，亦可望大幅提昇抑癌基因與抗癌藥物的篩選與研發速度。目前，本發明已被接受發表於下個月的BioTechniques國際科學期刊，並經中華民國智慧財產局核准給予新型專利，專利權號新型第M240450號，專利權期間自民國93年8月11日至102年6月17日止。
《文：技術移轉室；攝影：陳麗秋； 圖: 張文祥助研究員》