第 664 期

研究發展
B型肝炎慢性感染與疫苗反應之IgG抗體免疫總譜特徵
Network signatures of IgG immune repertoires in hepatitis B associated chronic infection and vaccination responses

當未具免疫力的成人受到B型肝炎病毒感染，大部分患者會自行痊癒；但許多嬰兒在產程中暴露於母親B型肝炎病毒後，即使接受疫苗接種或甚至免疫球蛋白預防處置仍成為慢性B型肝炎帶原者。IgG抗體免疫總譜能反映出病原感染或疫苗注射的免疫改變，藉由抗體免疫總譜分析就能一窺人體為保護自身而具備的調節能力。本院分子與基因醫學研究所劉鴻興助研究員級主治醫師結合次世代定序技術及自行開發出之程式，成功建立免疫總譜分析平台。

選擇B型肝炎作為開發免疫總譜分析的研究模型，是因為一方面慢性B型肝炎會持續感染，可尋找感染特徵序列；另一方面對疫苗具耐受性，不會產生有效抗體，與非帶原者在接受疫苗注射後比較觀察免疫總譜的改變，有利於發掘疫苗反應的特徵序列。此計畫收集4個家庭的兒童手足檢體，手足均是一人為B型肝炎帶原，另一人為非帶原者。研究團隊將B型肝炎帶原者與其非帶原者手足的IgG抗體總譜經PCR反應放大篩選出來後，進行次世代定序，再以自行開發出之程式分析出所有的CDR-H3（complementarity determining region 3, antibody heavy chain）胺基酸序列，進一步做主成分分析（principal component analysis, PCA）以得知各檢體序列之間的差異程度。結果發現帶原者間序列成分相近，反而手足間的序列成分差異很大；而且數量最多的前20%的IgG序列即可得到相似的PCA結果，顯示最有分析意義的序列為表現量較多的序列。接著將數量最多的前20%、且出現在2組檢體的22,250種序列，歸納出多個的CDR-H3群集，透過支持向量分類（support vector classification, SVC）與邏輯迴歸（logistic regression, LR）分析鑑定出相關群集，僅有一個CDR-H3群集由27個相近胺基酸序列組成為高度相關，且這個群集序列僅出現在帶原者中（圖一A, B）。若將分析序列擴大到所有的458,171種序列，群集序列數也增加到222個（圖一C），分析此CDR-H3群集之分布主要在帶原者免疫總譜中，非帶原者則少有這群序列出現，顯示這個CDR-H3群集可作為慢性B型肝炎的感染標記（圖一D）。


圖一：分析兒童帶原者的CDR-H3群集：(A)將數量最多的前20%、且出現在2組檢體的22,250種序列，歸納出序列相近的CDR-H3群集，經由支持向量分類（SVC）與邏輯迴歸（LR）分析鑑定出一個由27個相近胺基酸序列組成的CDR-H3群集，此群集序列僅出現在帶原者中（符號●）；(B)27個序列群集之胺基酸序列；(C)將分析序列擴大到所有的458,171種序列，有高度相關的CDR-H3群集也增加到由222個胺基酸序列組成，大部分出現在帶原者（符號●），○符號標示也出現在非帶原者的序列；(D)222個序列的CDR-H3群集占IgG總譜的百分比。

為從龐大IgG抗體免疫總譜找出非帶原者兒童對疫苗注射所產生的CDR-H3群集，劉醫師研究團隊首先稀薄化（rarefaction）總譜序列，再依出現次數分群，找出與序列種類變化一致的族群來分析兒童非帶原者的群集。透過支持向量分類（SVC）與邏輯迴歸（LR）分析，鑑別出6個相關的CDR-H3群集（圖二A），這6個CDR-H3群集只出現在非帶原者的檢體，以注射疫苗後兩個星期的檢體又更為顯著（圖二B），而每個兒童對B型肝炎疫苗所產生出的免疫特徵序列均不同，顯示出人體產生B肝抗體機制的複雜性。


圖二：分析兒童非帶原者的CDR-H3群集：(A)透過支持向量分類（SVC）與邏輯迴歸（LR）分析，鑑別出6個高度相關的CDR-H3群集。符號表示有最高的連結數（PageRank score）作為群集中心；(B)將6個CDR-H3群集在每個檢體所占IgG抗體疫苗總譜的百分比作圖，發現此6個群集只出現在非帶原者的檢體，而且在注射疫苗後兩個星期尤其顯著。其中兩個非帶原者有兩組CDR-H3群集，而另兩個非帶原者各有一組CDR-H3群集。

若以相同策略分析成人非帶原者CDR-H3群集在疫苗注射後的變化，則鑑別出9個相關的CDR-H3群集。從群集的組成形狀及數目可看出成人產生的免疫特徵序列比兒童複雜得多。最特別的是有檢體在疫苗注射前即偵測到另一檢體疫苗注射後的相同3組免疫特徵序列，應跟台灣地區提供健保B肝疫苗注射有關，也顯示可能經反覆接觸B肝抗原才能產生最有效果的抗體群。淋巴球受體變異區的研究在過去受技術的限制只能小規模地做定性的研究，透過此免疫總譜分析平台，能更全面地評估抗體反應。後續將可陸續應用到其他的疾病。研究成果已發表於Scientific Reports (2016 May 25;6:Article number 26556)。
《文/圖：分子與基因醫學研究所劉鴻興助研究員級主治醫師、張雅惠研究助理》