NHRI Communications

第 698 期

院務紀事
核心儀器設施中心淺談次世代核酸定序（NGS）技術與應用—16S菌種鑑定之新服務
NHRI to provide next generation sequencing service

1984年開始的人類基因體計畫，以第一代Sanger定序方法耗時超過10年花費30億美元的資金，才完成整個人類基因體的定序。2007年次世代定序（next generation sequencing, NGS）技術問世，整體定序技術開始快速地演進與發展，大幅降低定序所需的成本和時間，至今單次輸出已可達540-600 Gb（Illumina system）的資料量，再結合生物資訊分析的技術，NGS已廣泛應用於各學術研究領域。

目前NGS技術可應用於下列研究：

DNA level:

全基因體定序（whole genome sequencing）
新基因（genome de novo）
外顯子與目標區域（exome & target region）
ChIP sequencing

RNA level:

轉錄體（Transcriptome）
微核糖核酸（miRNA）expression

特殊項目（Special Project）:

表觀遺傳學（甲基化）（（epigenetics (methylation)）
菌相分析（metagenomics）

而其中菌相分析的應用更可大幅降低研究人員之經費與時間。利用原核生物的核糖體中的16S 核糖體RNA（16S rRNA），（因於演化過程中改變的程度相當的低，大多數16S rRNA中有V1~V9共9個高度變異區域（high variable regions, HVRs）），透過選擇其中V3~V4高變異區的序列，進行 PCR 專一性序列放大，經過MiSeq 300 bp paired end定序，並搭配資料庫之組建，將序列作為分類與鑑定生物體內或環境（如土壤）微生物之種類與群落，此亦為核心儀器設施中心近期將開始提供之NGS樣本建庫（library）製備的技術之一。

將來院內研究人員如欲使用核心實驗室所提供的16S菌種鑑定定序建庫（library）服務，樣本準備時須注意以下事項：

DNA的量至少要有500 ng以上，須含大片段DNA（>10 kb），可自行以電泳圖先行判斷，並由核心實驗室進行最後的Bioanalyzer測定判別。有無大片段DNA將是影響建庫成功與否的重要關鍵。
有無RNA殘留。可利用NanoDrop（會測得DNA+RNA）與Qubit（單測DNA）來測量濃度數值，如差距太大表示有RNA 殘留，需再使用RNase處理檢體。
採集糞便檢體要注意即時低溫（冷藏或冷凍）保存，或使用糞便穩定採集管，以保留原始的菌相分析狀態。

《文/圖：核心儀器設施中心粘書瑋、蘇特立》