第 279 期

會議報導
演講紀要：探討Prostacyclin在內皮細胞裡的保護機制
Lecture Summary: The Protective Mechanism of Prostacyclin in Endothelial Cells

本院於10月31日至11月2日舉行血管生物學研討會（2008 NHRI Vascular Biology Conference），地點為本院會議中心之國際演講廳，參加人數逾兩百人，研討會主題如下：
Session I - Angiogenesis & Vasculogenesis（血管新生與脈管生成）
Session II - EC & Smooth Cell（內皮細胞與平滑肌細胞）
Session III - Neural Regulation（神經調控）
Session IV - Vascular Diseases; Vascular Injury & Inflammation（血管疾病：血管損傷與發炎）
Session V - Septic Shock（敗血性休克）
Session VI - Gene Transcripition & Signaling Transduction（基因轉錄與訊息傳導）
Session VII - Blood Cell & Vessel Wall Interaction（血球與血管壁相互作用）
其中細胞及系統醫學研究所劉俊揚助研究員以「探討Prostacyclin在內皮細胞裡的保護機制」發表專題演講，謹摘要其精采內容於次。

本研究為探討Prostacyclin（PGI2）在保護血管內皮細胞（endothelial cells）存活所扮演之角色，基於劉俊揚博士對於細胞凋零（apoptosis）具相當之興趣，進而開始研究可能的相關機制。劉博士的演講針對三個部份進行介紹。第一部分是發現PGI2可能經由活化PPARδ來誘導內皮細胞裡14-3-3之蛋白質表達，細胞內14-3-3之增加會與Bad結合並減少Bad轉移到粒線體上，此反應進一步減緩經由粒線體所引起之細胞凋亡。第二部分是PGI2透過Ras依賴性的訊息傳遞路徑增加endothelial nitric oxide synthase（eNOS）的蛋白質轉錄調控（transcriptional regulation）。第三部分是介紹PGI2透過Ras依賴性的ERK活化可能透過磷酸化作用機制（phosphorylation mechanism），保護X-linked inhibitor of apoptosis蛋白質（XIAP）被蛋白酶體（proteasome）分解。這三個訊息傳遞路徑可以一起作用保護血管內皮細胞，防止細胞凋亡。

在若干多環氧化酵素（cyclooxygenase, COX）下游的前列腺素（prostaglandins）產物中，最熟知主要跟保護細胞有關的是PGI2跟PGE2。研究團隊在這幾年陸陸續續找到幾個與細胞存活有關PGI2可能之目標因子，第一是與PGI2可能有crosstalk關係的nitric oxide生成酵素。此外在探討PGI2之保護細胞的效果時所進行caspases跟Bcl-2 family蛋白質的一些分析試驗，發現PGI2有保護caspase活化的作用。在進一步研究其上下游相關聯之機轉作用中，發現其中比較有趣的是inhibitor of apoptosis protein (IAP) family，尤其是XIAP蛋白質。由於在探討Bcl-2 family之實驗中，其蛋白質本身的表現並沒有受到PGI2的改變，而有趣的現象是PGI2會減少在誘導細胞凋亡時Bad轉移到粒線體。由於14-3-3調控Bad轉移到粒線體之機轉主要是透過與Bad結合並控制其在細胞漿（cytosol）之中，因此探討PGI2對14-3-3之調控也就成為實驗室研究的方向之一。


由於利用liposome於內皮細胞之轉染效率不高，然而腺病毒（Adenovirus）載體於內皮細胞在基因轉染（transfection）效率上卻十分良好，因此研究團隊利用腺病毒載體系統對內皮細胞進行轉染實驗。首先將Ad-COPI(COX-PGIS)轉染至HUVEC細胞時，發現利用H 2O 2誘導的內皮細胞細胞凋亡會被Ad-COPI的過度表現（over-expression）所減緩。除了使用腺病毒基因傳遞方式外，穩定性PGI2類似物─carbaprostacyclin, cPGI2，亦有相同的保護效果。然而處理PGE2之結果顯示並無類似之保護，因此往後的研究實驗便主要集中在PGI2上。

一般來說，PGI2是透過在細胞膜上的一個IP受體（receptor），透過small G蛋白質增加cyclic AMP然後活化PKA訊息傳遞路徑。此外在後來的研究中被發現PGI2有可能是PPARδ的配體（ligand）並活化PPARδ的訊息傳遞路徑。研究團隊利用PKA的抑制物阻擋其活化，發現對PGI2保護H2O2誘導性的細胞凋亡並無顯著影響，因此排除PKA參與之可能性。第二步利用Ad-PPARδ過度表現PPARδ時，發現Ad-COPI與Ad-PPARδ會協力減少H2O2引起之細胞凋亡。此外利用PPARδ的selective ligand， L-165041所得到之結果與Ad-PPARδ之保護效果相似，因此證實PPARδ可能是一個主要的調控機轉。

由於先前的實驗結果發現Bad蛋白質的轉移有所改變，所以進一步著眼於14-3-3蛋白質之上。14-3-3在所有哺乳類動物裡面，有7個同型體（isoforms）。研究結果發現PGI2或L-165041活化PPARδ之後，其中有幾個同型體會增加，但最主要的是epsilon (ε)同型體。而使用siRNA將PPARδ knock down後，上述的增加情況會被減緩，進一步證實PPARδ對14-3-3調控之重要性。由於ε同型體在所有哺乳類動物裡之相似度最高，且在這項研究裡為誘導增加效果最顯著之isoform，因此便利用其做為爾後研究之實驗model。為探討調節14-3-3的機制，首先，研究團隊複製出人類5’端約1.6 kb的14-3-3ε啟動子區（promoter region），進一步在DNA定序分析過程中，發現大約在-1.3 Kb的位置可能有PPARδ之結合位置（binding site）。接著利用製造各種不同基因缺失（deletion）的14-3-3ε啟動子區，在刪除掉PPARδ可能的結合位置之後，發現PPARδ與COPI過度表現後所增加的啟動子活化效果便即消失，因此證實此區域對PPARδ結合的反應元件（response element）之重要性。此外亦利用染色質免疫沉澱（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）的方式，將PPARδ的抗體免疫沉澱後用PCR定量，發現PGI2 跟L-165041會增加與PPARδ與反應元件區域之結合。進一步證明這個結合作用對於14-3-3基因調控是必要的。

研究的第二部分想了解PGI2與eNOS間是否有crosstalk之現象。使用轉染的方式來測量eNOS的磷酸化作用，並沒有發現明顯的改變，但處理PGI2明顯增加eNOS蛋白質之表達。此外eNOS的啟動子活性亦為PGI2所誘導增加。


由於PGI2調節eNOS之詳細訊息機制並未清楚。劉博士的研究團隊利用PI3K、MEK和PKA抑制物進行實驗，結果發現Ad-COPI過度表現所產生的PGI2會增加eNOS的啟動子活性，而MEK之專一性抑制物─PD98059─則會阻止eNOS為PGI2所誘導。相反的，PI3K或是PKA的抑制物就沒有明顯抑制效果，因此推測MEK-ERK是一個調節eNOS主要的訊息傳遞路徑。研究中亦發現PGI2可誘導內皮細胞ERK磷酸化，但這個機制是經由IP receptors還是經由PPARδ，目前還是未知。此外為了進一步證明MEK-ERK對於上述現象的重要性，實驗室建立3種Ras細胞株，控制組EC-RasCTR、實驗組EC-RasCA（會固定活化Ras-Raf-MEK-ERK的細胞株）及EC-RasDN（DN: dominant negative mutant）。研究結果發現在EC-RasDN的細胞株中，過度表現Ad-COPI所誘導的eNOS啟動子活性相形減緩，因此證實Ras所扮演之重要角色。

第三部份在對幾個IAPs的蛋白質表現研究中，發現H2O2誘導的細胞凋亡會選擇性地減少XIAP和Survivin。處理PGI2會劑量依賴性（dose-dependence）恢復 XIAP之表現，但對survivin則無影響。由於已知IAPs主要功能是直接與caspase相互作用並抑制caspase的活性，並進一步增加caspase本身的蛋白質泛素化作用（ubiquitination）與降解作用（degradation），為了證實PGI2選擇性地保護XIAP是否透過此proteasome之機制，研究團隊發現加入proteasome抑制劑後有效地恢復H2O2處理所減少之XIAP表現，接下來對XIAP ubiquitination的研究，也結果發現cPGI2可有效地抑制H2O2引起之XIAP ubiquitination，並發現MEK-ERK的抑制物會有效地阻擋PGI2恢復XIAP及減少ubiquitination之功能。此外利用所建立的穩定性細胞株研究發現，PGI2所減少的XIAP degradation在EC-RasDN細胞裡並無明顯之效果。這些研究結果證實MAPK-ERK的重要性。


總結整體研究結果，劉博士的研究團隊提供了幾個證據：
一、PGI2活化PPARδ表達14-3-3ε；
二、PGI2誘導eNOS的表現，產生nitric oxide；
三、PGI2經由Ras所調節的ERK訊息傳遞路徑，來防止XIAP發生降解作用。
這幾個機制協力共同保護內皮細胞免受外來刺激所引起之傷害。
《文圖：細胞及系統醫學研究所劉俊揚助研究員演講；編輯中心劉盈秀整理》