第 394 期

學術交流
「快速檢測」與「低成本檢測」技術之新知分享
Next Generation Diagnostics for Infectious Diseases Workshop

「The 14th International Conference on Emerging Infectious Diseases in the Pacific Rim」於2010年10月4至7日在馬來西亞檳城舉行。此年會是由美國國家衛生研究院（National Institutes of Health, NIH）主辦，會議討論主軸為應用於感染症的「快速檢測技術」與「低成本檢測技術」之發展。在此，將會議中提到的兩項分子檢測技術：(1) Metagenomic Diagnosis、(2) Nucleic Acid Diagnostic Test for Low Resources Settings (Loop-mediated isothermal amplification of cDNA, LAMP)，分別描述如下：

Metagenomic Analysis
此技術可以應用於未知感染症的診斷，包含3個部分：(1) 以rapid determination技術增幅未知的核酸；(2) 再以next-generation sequencer快速定序；(3) 最後藉由BLASTN search分析序列為何致病原。
1. rapid determination可分為以下3個步驟：
(1) 萃取出檢體的DNA和（或）RNA，若欲偵測的序列為RNA（如懷疑RNA病毒感染），則以random primer做出cDNA，並以cDNA為模板做出互補的另一股；
(2) 以限制脢切割雙股DNA，爾後在切口接上稱為adaptor的序列；
(3) 以adaptor序列為primer定序，獲得adaptor之間的序列（如圖一，即以未知的RNA為增幅對象為例）。

此外，該系統已有研究人員將其使用的限制脢增加為兩種，兩端分別切為blunt end與sticky end，提高正確接上adaptor序列的機率（如圖二的紅色方框部分）。

2. next-generation sequencer（NGS）：
傳統的Sanger sequencing machine能同時對100條序列，每條序列定出800鹼基。NGS以454’s GS FLX機型為例，能同時對40萬條序列，每條序列定出250鹼基。此大大加速了對多條序列的定序速度（Cell. 2008 Mar 7;132(5):721-3.）。

3. BLASTN search：
對多項序列，以Perl程式語言整理序列，對MySQL的sequence database做local blast。比對分析序列的近似性後，呈現檢體中各種序列的比重為何（如圖三）。

以一個腹瀉的研究為例，表一中呈現出一個病人腹瀉時的糞便檢體，與其康復3個月後的檢體。藉rapid determination比較兩者檢體所含序列的比重，呈現出腹瀉檢體中存有Campylobacter jejuni（sequence number = 156:0），有助於對感染源未知時，快速診斷。


Loop-mediated isothermal amplification of cDNA（LAMP）

LAMP技術的關鍵在於特殊的primer設計以及一個具有「置換template模板股」活性的DNA 聚合酶，這個方式中的primer分成兩個部分，一部分（primer的5’端）能直接和template的3’端互補結合，另一部分（primer的3’端）則藉由一次轉折後（形成一loop），和template略接近5’端的序列互補。

這個環狀的摺疊使得PCR產物，除了loop區域之外，其餘部位形成雙股，但loop區域的單股結構，讓primer能夠黏合上，開始下一步PCR。每一次增幅後，在5’端會因環狀摺疊形成一段單股的loop，讓primer能繼續接上持續增幅。

LAMP的優點在於每次增幅後，不需要以高溫（94℃）將PCR產物變性（denature）為單股，便能有一段單股結構讓primer黏合，持續PCR的反應，故只需在65℃便能完成反應，不需要具升降溫功能的聚合脢連鎖反應器（PCR machine）。圖四中第15項的圖案便是連續反應後的產物。然而該反應的缺點在於，會做出長度不同的產物（圖五），在電泳上只能鑑別有無增幅反應，但不適由PCR產物的尺寸判讀是否有非特異性的增幅。若欲鑑別是否有特異性的增幅，需再藉由南方墨點法（southern blot）以特異性的probe確認是否成功增幅出期待的PCR產物，南方墨點法或可改以免疫層析法（immunochromatography）替代，減少檢驗所需的時間。

本次會議筆者亦參與發表壁報論文之題目為「Evaluation of Virus Culture and Molecular Method for the Detection and Serotyping of Human Enteroviruses Using Throat Swabs」，同時感謝美國國家衛生研究院（National Institutes of Health, NIH）全額獎助與會經費。此行汲取了「快速檢測」與「低成本檢測」的新技術，除有助筆者於傳染流行病學研究的應用，也在此將新知與讀者們分享。
《文：感染症研究組江百善研究助理；編輯中心趙孝茜整理》