第 412 期

院務紀事
超解析影像暨全內反射螢光顯微鏡簡介
Introduction to super resolution microscope

廣視野螢光顯微鏡長久以來都是學者們研究探討生物樣品及實驗進行的重要工具之一。然而，一般顯微鏡技術受限於光學繞射極限，其XY光學解像力僅0.2μm左右。若研究人員想要觀察的目標物小於0.2μm時，就必須要使用電子顯微鏡才能分析辨別。不過使用電子顯微鏡對生物樣品而言，卻有必須脫水、塗層甚至抽真空等不適當的限制步驟，因此並不適用於多數的生物樣品或活體細胞。如何突破光學極限，以達到清楚觀察細胞結構與分子活動，就成為學者們所極力探討與研究的重要議題。2010年超解像力螢光顯微鏡系統N-SIM（Nikon-Structured Illumination Microscopy）正式於亞洲區推出，此系統擁有高於一般光學技術2倍以上的解像力，還能同時以0.6秒/幅的時間截取所需影像，充分達到生物研究領域活體影像擷取的需求。本院核心儀器設施中心已於近日購置此系統。

特性
1. 超越光學螢光顯微鏡及雷射共軛焦顯微鏡雙倍以上的XYZ解像力
此系統利用結構式照明顯微技術（structured Illumination）於顯微鏡光路中架設所需組件，並搭配Nikon開發之特殊演算法，運用Moiré effect的原理，將來自兩種不同方向的空間頻率重疊，並將擷取之影像資訊透過傅立葉運算轉換為原本損失無法觀察的細部空間頻率，進而獲得高於原光學系統2倍以上的光學解像力影像。

根據實驗結果顯示，無論是傳統螢光顯微鏡或雷射共軛焦顯微鏡均無法與N-SIM的超解像力相比擬。測試結果更顯示N-SIM系統最佳橫向XY解像力可達85nm，縱向Z解像力可達200nm，實際圖檔如下圖所示。


2. 0.6秒/幅高速影像擷取速度
除了提供高解像力影像之外，N-SIM系統更擁有此類系統中最快的影像擷取速度。在2D-SIM及全內反射螢光影像系統（total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM）-SIM的模式下可達0.6秒/幅之影像擷取速度，在3D-SIM的模式下可達1秒/幅之影像擷取速度，因此可有效進行活體細胞觀察實驗。

3. TIRF-SIM影像技術
相較於傳統的全內反射螢光影像系統，新研發的TIRF-SIM顯微影像技術提供更高光學解像力的全內反射螢光觀察，可獲得細胞膜附近更多的細節訊息。N-SIM無須擴充及可擁有此影像掃描模式，更提供了學者們多重的選擇性及實驗設計構想。

4. 3D-SIM影像技術
除了2D-SIM之外，新研發的3D-SIM顯微影像技術更可對樣品進行光學切片掃描，並可在20μm的厚度內以更高的光學解像力呈現更多細胞細部結構影像，其包含XYZ的光學切片影像，能讓研究人員在觀察探討蛋白間相互位置時，更加精準的判斷結果。

本院之系統配備完整，擁有上述3種超高解析掃描模式2D-SIM、3D-SIM及TIRF-SIM，供使用者根據實驗樣品不同自由選擇。激發光源搭配488nm及561nm雷射，適用於多數綠螢光蛋白及紅螢光蛋白影像擷取，藍光影像則可藉由一般螢光系統擷取並重疊於另兩色高解析圖檔以成為多重螢光影像。
《文/圖：Nikon、本院核心儀器設施中心》