第 437 期

研究發展
探討肺結核桿菌北京株不同基因型與疾病傳播及抗藥性的相關性
NHRI researchers report genotypic analysis of genes associated with transmission and drug resistance in the Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis

時至醫藥發達的今日，肺結核仍是全世界所關心的健康議題，根據世界衛生組織 （World Health Organization, WHO）的估算，全球約有三分之一的人口曾受到結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的感染，每年約有300萬人死於結核病。雖然在台灣肺結核的發生率與死亡率從1950年後呈現穩定下降的趨勢，但在2001年卻爆發14,486個感染案例，每10萬人就有 65人曾遭受到感染；因此，在台灣肺結核仍是個需要高度監控的傳染性疾病。

能夠造成感染的結核桿菌株有許多種，本所過去的研究顯示，不同結核菌株會與族群的遷移演化有關（圖一），其中的北京株（Beijing strain）因具有快速的傳播能力，且常與結核病的大爆發有關，因此備受全球關注。目前北京株的感染率占全球肺結核感染案例的10%以上，在東亞及東南亞地區甚至高達50%以上，報導也指出具有多重抗藥性（multiple drug resistance, MDR）的菌株大多屬於北京株。最近的研究發現全球主要的致病菌株是摩登型（modern strain）北京株（在染色體上的NTF基因有IS6110片段嵌入），但古老型（ancient strain）北京株（染色體上保留完整的NTF基因）卻是日本主要的流行菌株。本所之前的研究指出台北地區出現的結核桿菌北京株大多屬於摩登型北京株，推測經過時間的演化，摩登型北京株已經變成區域性的疾病了，因此台灣地區北京株演化的調查，對於瞭解病菌為何具有高度致病性，以及如何適應台灣地區的宿主條件都有很大的幫助。本篇的研究利用單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）變異、在NTF基因上有無IS6110片段嵌入、有無大片段多型性基因（RD105、RD207、RD181、RD142和RD150）出現，以及在DNA修復基因（mutT2、mutT4和ogt）上有無非同義單核苷酸多型性（non-synonymous SNPs, nsSNPs）出現等方法來對樣本進行分析。最後再利用結核桿菌散置重複單位分析-變異性重複序列分析法（Mycobacterium interspersed repetitive units - Variable number of tandem repeats, MIRU-VNTR）將所有樣本進行分析，推算患者間可能的流行病學關聯性。本篇的分析結果能夠幫助更加瞭解北京株的基因結構並擴大從VNTR方法所得到的訊息。


結核桿菌北京株的分子多型性和抗藥性
所收集的338株北京株結核桿菌可再細分出9種亞型（表一），其中的ST11和ST26亞型株因具有完整的RD181變異區和NTF基因，因此在演化年齡上是相對古老的菌株，而其他的ST3、ST10、ST19、ST22、ST25、STK和本研究所發現的STN亞型，因為RD181變異區均有缺失，有些還同時有IS6110片段嵌入NTF基因，因此這些亞型株在演化年齡上是相對摩登的菌株。在所發現的亞型株中ST10（53.3%）的出現率最高，其次分別為ST19（14.8%）及ST22（14.5%），而這3株亞型均屬於摩登型北京株。



將所有338株臨床菌株進行藥物抗性試驗（isoniazid、rifampicin、ethambutol和streptomycin），若對上述4種藥物均有感受性則標示為S，若對其中任何一種藥物具有抗藥性則標示為R，若同時對isoniazid和rifampicin具有抗藥性則標示為MDR（表一）。結果顯示在北京株9種亞型中，ST26亞型出現多重抗藥性菌株的比例（18.5%）較其他8種亞型高。

過去的研究指出，Ag85複合體上的fbpA和fbpB基因的單核苷酸多型性可用來區分古老型北京株和摩登型北京株，但本篇的研究結果發現，只有fbpB基因上密碼子238的位置產生單核苷酸多型性變異可用來區分是否為摩登型北京株（表二）。本研究並檢測與DNA修復相關的基因（mutT2、mutT4、ogt12和ogt37）是否有錯義突變存在，結果發現上述4個基因在所有摩登型北京株亞型中（ST3、ST10、ST19、ST22、ST25、STK和STN）均有不同比例的突變出現，而古老型北京株亞型ST11和ST26在這4個基因中並無任何的突變產生。這樣的結果推論，摩登型北京株的菌株其與DNA修復相關的基因都有突變存在，但這些突變與多重抗藥性的產生並無相關（表一）。另外，ST10亞型有相對高的群組形成率，表示其具有高度的傳染力。




MIRU-VNTR和RD分型將北京株進行演化分類
利用24個基因位點的MIRU-VNTR分析法將實驗樣本進行群組分類（圖二），結果發現此法對於摩登型北京株的解析力不佳，無法將摩登型北京株進一步細分，此與之前日本研究團隊所發表的結果相近。而古老型北京株ST11和ST26在最小生成樹（minimal spanning tree, MST）中的位置遠離其他北京株亞型，表示ST11和ST26與摩登型北京株只有遙遠的基因關係。


為了更有效地重現變異區（RD）分析所呈現的演化結果，研究團隊進一步加入所有樣本的單核苷酸多型性分析結果進行解析。RD群組1（RD105變異區有缺失），只有1個ST11亞型的菌株屬於此群組；RD群組2（RD105和RD207變異區有缺失），30個ST11和ST26亞型的菌株屬於此；RD群組3（RD105、RD207和RD181變異區有缺失），225個分屬ST3、ST10、ST19、ST22、STK和STN亞型的菌株屬於此；RD群組4（RD105、RD207、RD181和RD150變異區有缺失），43個ST10和ST19亞型的菌株屬於此；RD群組5（RD105、RD207、RD181和RD142變異區有缺失），32個分屬ST3、ST10、ST19、ST22和STK亞型的菌株屬於此；RD群組6（RD105、RD207、RD181、RD142和RD150變異區有缺失），7個ST10和ST19亞型的菌株屬於此。在RD群組1和2中，RD181變異區並無缺失，在NTF基因上也無IS6110片段嵌入，表示此兩群組為相對古老的北京株群組（圖三）。

結語
結核桿菌北京株為何能在全球成功的散播原因還不清楚，推測可能和不同的宿主相關因素有關，例如：人類族群的遷移、全球卡介苗（BCG）疫苗的普及所造成的選擇性壓力、對於抗藥性菌株無效的治療等，均會增加結核桿菌的傳播時間。另外，細菌對於壓力環境有高度的適應性可能也是原因之一，例如：宿主免疫反應的馴化或是抗結核桿菌藥物的使用，使得細菌的突變機率增加進而提高其生存率，對細菌而言這反而是一個有利的選擇條件。在北京株中與DNA修復相關的基因如：mutT2、mutT4和ogt等都存在有獨特的錯義突變，但最近的研究結果指出mutT2與DNA的修復無關，其功能與有效調節細胞苷三磷酸（cytidine-triphosphate, CTP）的利用有關，或許這是北京株能夠表現突變mutT2基因的原因，而近年來摩登型北京株的傳播率和感染率有逐漸上升的趨勢，推論和mutT2及mutT4基因突變有關。本研究發現除了ST11和ST26亞型外，所有北京株的mutT2、mutT4和ogt基因均有突變產生，但這些基因的突變與菌株多重抗藥性的產生並無相關。本篇的研究也發現，ST26亞型的菌株產生多重抗藥性的機率較其他亞型的菌株高。另外研究結果顯示古老型北京株來自兩個不同的起源（圖二），這與之前國外的研究結果相似，但這雙起源的可能性還需要再做進一步的研究。

之前的分析顯示傳統亞型ST1為台灣地區北京株最主要的型式，近年來由於生物技術的進步可以再細分出ST3、ST10、ST19、ST22和ST25等數種亞型，這些摩登型北京株因具有高度傳染力，因此可以快速地在全球各地散播，過去有研究指出BCG疫苗的接種對摩登型北京株而言是一種正向的選擇壓力，本研究結果支持這樣的論點。

本所之前的研究結果指出，結核桿菌在台灣地區主要的流行菌株為摩登型北京株，且摩登北京株在20歲以下年輕族群更占多達85%以上，可能與BCG的施打有關。最近的研究發現，80%的摩登型北京株會產生大量的酚醣脂（phenolic glycolipid, PGL）抑制宿主細胞前發炎因子的產生，因此推測北京株較具致病性。結核桿菌所產生的Ag85複合體可以幫助其逃脫宿主的免疫防禦機制，雖然其他研究團隊指出，檢測Ag85複合體內fbpA和fbpB基因的單核苷酸多型性變異可以區分出古老型和摩登型北京株，但本研究發現，只有fbpB基因的單核苷酸多型性分析有此區分功能，也證實大多數北京株的mutt基因有突變存在，且在RD181變異區有缺失產生。雖然ST26亞型的北京株產生多重抗藥性的比例偏高，但此亞型菌株的mutT2、mutT4和ogt基因並無單核苷酸多型性變異存在，表示這些基因與多重抗藥性的產生並無相關。本研究顯示不同的北京株族群對於宿主免疫反應及藥物的適應機制均不相同。

原著：Chang JR, Lin CH, Tsai SF, Su IJ, Chen YT, Chiueh TS, Sun JR, Huang TS, Chen YS, and Dou HY. Genotypic analysis of genes associated with transmission and drug resistance in the Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2011 Sep;17(9):1391-6.
《文/圖：感染症與疫苗研究所蘇益仁所長、杜鴻運助研究員、張嘉茹研究助理》