第 594 期

學術交流
日本國立感染症研究所流感病毒研究中心參訪心得
Visit report to National Institute of Infectious Diseases, Japan

日本國立感染症研究所（NIID）是隸屬於衛生勞動福利部的政府機構，目前下轄19個部門和5個中心，其中包括流感病毒研究中心（IVRC）。日本NIID的任務包括：(1)傳染病基礎和應用研究；(2)感染性疾病諮詢服務；(3)傳染病監測；(4)生物製品及抗生素的質量控制研究；(5)國際合作；(6)國內外研究人員的培訓；(7)大眾教育。NIID的流感病毒研究中心成立於2009年4月，是目前世界衛生組織合作中心、世衛組織國家流感中心、世衛組織H5參考實驗室和世衛組織法規管制實驗室。台灣於2003至2012年發生新型禽流感H5N2病毒流行，此H5N2病毒的HA及NA基因來自北美型H5N2病毒，其餘6段基因來自台灣H6N1病毒，由於此病毒是台灣特有，因此政府有責任控制這些H5N2病毒，防止其傳播國際，並製備人用疫苗病毒株，以備不時之需。因此，本院結合農委會家畜衛生試驗所、衛生福利部疾病管制署和國防部預防醫學研究所，進行H5N2疫苗種株之製備工作，這是台灣第一次嘗試製備合乎國際規範的流感重組疫苗病毒以及標準品的製備，因此藉由此次參訪WHO參考實驗室來學習他們經驗是相當重要的。Dr. Masato Tashiro是日本NIID流感病毒研究中心的前任主任，也是本院感染症與疫苗研究所（簡稱感疫所）的顧問；透過他的介紹，感疫所一行人於2014年12月2至3日參訪流感病毒研究中心，並且共同召開技術討論會議。首先由該中心主任Dr Takato Odagiri介紹IVRC的任務分組，包括以下實驗室：(1)流感病毒監測；(2)診斷系統和實驗室培訓的開發；(3) 流感疫苗品質控制；(4)製備符合GMP規範的疫苗病毒種株；(5)細胞培養疫苗研發；(6)鼻噴劑疫苗研發。

本院感疫所李敏西博士介紹本院的流感疫苗研發進展，從2005年起，本院已經建立了兩個細胞培養平台（MDCK和Vero細胞），用於生產H5N1流感疫苗；其中MDCK細胞平台已完成第1期臨床試驗，並技轉給國內廠商，而Vero細胞平台已取得美國及台灣專利，正尋找合作廠商。2003年底到2004年3月，台灣家禽養殖場曾發生低病原性禽流感H5N2病毒流行，2008年家禽養殖場又出現禽流感H5N2病毒流行，雞隻致病力測試顯示其致病力已比2003年的病毒強，2012年家禽養殖場又發生禽流感H5N2病毒流行，雞隻致病力測試顯示其致病力已達到高病原性的標準。基因序列分析結果顯示，台灣近年流行的H5N2病毒具有獨特的基因組合，其HA及NA基因來自美洲H5N2病毒而其餘6段基因與台灣H6N1病毒相似，這是全球首次發現，且已經在台灣成為在地化病毒。疾病管制署針對家禽工作者監測的結果顯示：並無具臨床症狀之人類H5N2禽流感感染病例，然而，血清學結果顯示，家禽工作者的H5N2禽流感病毒抗體盛行率為2.4%，顯著高於非家禽工作者，間接證實台灣已有人類之不顯性H5N2禽流感感染。因此由上述研發團隊共同建立本土H5N2疫苗開發平台，具體研究成果如下：(1)根據基因資料分析選擇2003年1株低病原性病毒株及2012年1株高病原性病毒株製備雪貂抗血清，雪貂抗血清資料分析顯示：2003、2010、2012及2014年的H5N2分離株沒有顯著抗原差異，但與其他國家流行的H5N1病毒抗原差異很大，因此H5N1病毒與H5N2病毒之間無交叉保護力；(2)將2012年高病原性病毒以鼻腔接種方式感染4隻雪貂，未發現臨床症狀，不過可從鼻腔沖洗液檢測到活病毒，此項指標可作為評估疫苗株之減毒；(3)挑選雞胚蛋及細胞馴化過的各1株高成長疫苗株當作主病毒種株，將其6段內部基因選殖到質體，建立兩組反向基因工程（reverse genetics, RG）平台，可分別製備適合雞胚蛋及細胞培養生產系統的重置疫苗病毒（reassortant vaccine viruses）；(4)根據基因及抗原性分析，選擇2010年1株高病原性、2012年高病原性及低病原性各1株，已將此3株病毒的HA基因經過修飾成只有1個鹼基，並將修飾過的HA及NA基因選殖到質體，選殖出適合雞胚蛋及細胞培養生產系統的候選疫苗株各2株（總共4株），此4株候選疫苗株已通過雞隻及雪貂毒力測試。本研究已順利建立新型流感疫苗株開發平台，此平台可應用在其他新型流感疫苗之開發，如H5N8及H5N3。此外，這是國內首次依據WHO規範製備新型流感疫苗株，可協助國內廠商快速生產新型流感疫苗，有助於國內因應新型流感所帶來的威脅，此外，這些疫苗株也可提供給其他國家使用，提升台灣國際地位，拓展衛生外交。

Nobusawa博士介紹了兩個計畫，是關於如何以雞蛋為基礎的生產平台，來開發新型流感H1N1和H7N9病毒疫苗。在H1N1計畫中，NIID使用Kawaoka博士所技術轉移的12質體RG技術，產生了7:1、6:2和5:3的重置病毒。他們發現，在以雞蛋為基礎的培養平台上，7:1重置病毒的生長比起6:2和5:3重置病毒，更有效率，並產生更高的抗原產量；該研究已刊登於日本期刊（Japanese Journal of Infectious Diseases 2013;66:65-68）。在H7N9計畫，NIID利用相同的反向遺傳學系統，生成3種6:2重置病毒（NIIDRG-10、NIIDRG-10.1、NIIDRG-10.2）。根據在雞蛋培養平台的抗原分析和生長效率數據，NIIDRG-10.1被選為生產疫苗用的病毒。因為它保持與病毒母株相似的抗原性以及具有更佳的生長效率。NIIDRG-10.1已被分發至日本各疫苗製造商，準備進行臨床試驗。然而，NIIDRG-10.1疫苗病毒是使用來自於Wisconsin州立大學和MedImmune公司所提供的技術。因此生產NIIDRG-10.1疫苗病毒的製造商可能需要支付權利金給Wisconsin州立大學和MedImmune公司，而限制了這種疫苗病毒的廣泛使用。

在動物實驗方面，先由本院感疫所的賈敏原博士介紹台灣目前H7N9流感病毒疫苗候選株在雪貂的保護效力。在H7N9疫苗株保護效力評估中顯示，感疫所利用狗腎細胞所產製的不活化流感H7N9全病毒疫苗（RG-268）免疫雪貂兩次後，不會產生流感相關連性的臨床症狀（如咳嗽、打噴嚏、體溫上升等），且能產生良好的中和抗體力價，再者經由RG-268免疫後進行H7N9野生病毒株攻毒的雪貂，其組織臓器內病毒量顯著性的較未免疫RG-268的雪貂低，證實疫苗的保護力，此成果已受國際期刊PLoS ONE接受發表。在H5N2流感疫苗株研究方面，感疫所已利用反向基因學的技術，產製2株H5N2疫苗候選株，1株為蛋源（egg-derived）H5N2 K2-PR8-2010疫苗株、一株為細胞源（cell-derived）H5N2 E7-V15 p11-2012疫苗株，同時選用4-6個月大，流感H5N2血清抗體呈陰性的雪貂，進行H5N2疫苗候選株的毒力試驗，結果顯示感染了H5N2疫苗候選株的雪貂，在感染後1-7天沒有表現出任何類流感臨床症狀。接著NIID的Asanuma博士介紹日本目前於生物安全第三等級動物實驗室內雪貂的飼養管理與實驗操作，由於雄性雪貂具侵略性等因素，NIID目前只用雌性雪貂進行流感相關研究。此外，Asanuma博士也介紹NIID收集雪貂鼻沖洗液的方法，首先使雪貂仰躺並以開口器打開雪貂的嘴巴，將2毫升PBS沖入喉頭部的鼻咽孔內，沖洗液由鼻孔流出後收集並分析，此方式較傳統由鼻孔正向沖洗的方法更能準確的定量，故本研究團隊日後也將使用此方式進行雪貂鼻沖洗液的收集。

本院感疫所胡勇誌博士在會議中提及4個WHO Essential Regulatory Laboratories（WHO ERLs）會因疫情的緩急而製備疫苗標準品。目前季節性或是大流行流感疫苗成品放行所需的流感標準抗原和抗血清通常由4個WHO ERLs製備提供，它有一個通用流程用於流感抗原的濃度之校驗，此流程是確保4個ERLs對新標定的流感抗原濃度，能夠在一個可確信的範圍，而標定後的流感標準品抗原濃度，也是提供各國疫苗檢驗單位及疫苗製造商標定抗原濃度重要參考依據。H5N2病毒株為台灣特有的病毒株，因此胡博士闡述本院為何需要自製的標準抗原和抗血清的原因。傳統上流感的抗血清製備是利用純化後高純度的病毒顆粒經由鳳梨酵素（bromelain）將流感病毒上的血凝素（HA）蛋白切除後，在經過超高速離心及透析等方法純化BHA蛋白（bromelain-cleaved HA protein），最後以高劑量免疫綿羊而取得抗血清。會中也分享了本院如何以H7N9病毒（NIBRG-268疫苗株）做為標準品製做範本。胡博士也提及實驗室已經可以製備H7N9標定的抗原的標準品，這個部分也得到衛生福利部食品藥物管理署針對H7N9抗原製備的委外計畫。但是抗血清的製備仍碰到一些困難，即便參照許多期刊文獻中的實驗方法都無法取得高純度的BHA，在報告後的討論上，日本NIID Itamura博士提到的所有ERLs實驗室也遭遇到相同的問題，H7N9 抗血清製備上極為不易。

接下來Shiegeyuki Itamura博士也報告日本NIID如何製備力價試驗（SRID）所需的標準抗原和抗血清。Itamura博士介紹了傳統鳳梨酵素之外，也介紹了Triton X-100的方法來製備H7N9抗血清。他展示了TRITON X-100方法所切割的HA更容易保持切割後HA蛋白的構形以及結構的穩定性，也建議我們可以嘗試Triton X-100的方法來製備H5N2標準抗血清。會議最後，胡博士說明了本院已建立一套一次性的14 L生物反應器平台來快速製造流感病毒標準抗原的流程，針對製備抗原部分，未來希望雙方有機會可以進一步的合作。
《文/圖：感染症與疫苗研究所胡勇誌助研究員、賈敏原博士、李敏西研究員》