第 724 期

研究發展
利用登革病毒NS3蛋白酶活性開發登革病毒偵測與定量之新型生物感測器
NHRI researchers develop a novel biosensor system based on dengue NS3 protease activity for efficient detection and quantitation of dengue virus

現行登革病毒檢測與定量方式主要為溶斑試驗（plaque assay）、免疫斑塊試驗（immuno-focus assay）、病毒感染價測定（TCID50）、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR），以及抗體檢測法（如酵素免疫分析法（enzyme-linked (immunosorbent assay, ELISA)）。溶斑試驗與病毒感染價測定，係可直接偵測活病毒數量，但須耗費數日，且不適用於無法形成溶斑或細胞病變作用（cytopathic effect, CPE）之臨床檢體。而改良後的免疫斑塊試驗，運用抗體偵測病毒特定抗原，但因步驟繁瑣，因此不適用於同時檢測大量樣本；RT-PCR則是偵測目標為基因數，而並非實際具感染活性之病毒量，最後的抗體檢測法則同樣須耗費數日，且對抗體品質（專一性、靈敏度）的要求較高，費用亦相對昂貴。

本院感染症與疫苗研究所陳信偉副研究員研究團隊建立一套新式檢測定量系統，利用登革病毒非結構蛋白NS3之蛋白酶（protease）活性，偵測及定量登革病毒。此系統是在活體細胞中穩定表現兩個模組—「NS3蛋白酶感測模組」和「Cre/loxP-開關報導基因表現模組」。感測模組係利用一個包含登革病毒NS3蛋白酶切位之內質網穿膜蛋白與Cre重組酶（Cre recombinase）作為融合蛋白，當細胞受登革病毒感染表現具有活性之NS3蛋白酶後，經過NS3蛋白酶進行水解後，可將Cre重組酶由內質網膜上釋放。隨後Cre重組酶進入細胞核，進而啟動Cre/loxP-開關報導基因表現（如下圖所示）。藉由偵測報導基因表現量，可反映出活病毒數量。


圖：偵測登革病毒NS3蛋白酶活性之生物感測器
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相較於現行普遍使用的登革病毒定量方法，此系統具有以下優勢：(1)更快速；相較傳統的數日，縮短為一日即可分析檢測；(2)操作簡易、低成本；透過horseradish peroxidase（HRP）報導基因之表現反映活病毒數量，因此無須依賴抗體標記，且只需單一步驟（one-step）加入TMB呈色受質（substrate），即可使用一般分光光度計檢測，無須使用昂貴儀器；(3)分析自動化、低人力；以多孔盤可快速測量許多樣品之吸光值，具高通量篩選的能力。相反的，溶斑試驗、免疫斑塊試驗以及病毒感染價測定則須仰賴相當人力做分析計數；(4)廣泛性；可廣泛檢驗並定量4種血清型之登革病毒檢體。此外，此系統更進一步推展為新式抗登革熱藥物之篩選平台，相較於現行藥物篩選方式，此系統除了可簡便且快速地檢測出多種候選藥物對登革病毒的抑制效率外，更可同時檢測出藥物之細胞毒性（cytotoxic effect）。

此發明所揭露之登革病毒偵測及定量方法，可大幅簡化傳統登革病毒之偵測程序，有效節省時間和人力，具有產業利用性與進步性，此項技術已獲得中華民國專利核可。
《文/圖：感染症與疫苗研究所陳信偉副研究員、謝明澍博士生》