第 334 期

研究發展
以佐劑對抗流感
NHRI researchers develop new adjuvant for influenza vaccine development

面對H1N1新型流感的威脅，疫苗是最有效的防禦措施。目前台灣所施打的H1N1新型流感疫苗有2種，一種為國內國光疫苗廠與日本北里藥廠技術合作製造的裂解病毒疫苗，不含免疫佐劑；另一種為瑞士諾華藥廠所製造的裂解病毒疫苗，含有MF59佐劑。從初期施打的結果顯示，不含免疫佐劑之疫苗在小孩身上需接種2次以上才能誘導出有效的免疫力。事實上，世界衛生組織（WHO）之諮詢委員會（Strategic Advisory Group of Experts on Immunization, SAGE）在H1N1開始蔓延之初，即建議各國藥廠在儲備疫苗當中添加佐劑（adjuvant），期能藉由免疫力的提升來降低劑量需求與接種次數，有效節約抗原的使用量。除此之外，添加佐劑於候選疫苗當中，亦能夠提升該疫苗對於抵抗力較弱的嬰幼兒、孕婦以及老年族群之免疫效果。本文將說明佐劑的作用，並介紹使用於流感疫苗的佐劑以及其研發現況。

傳統佐劑：鋁鹽與乳狀液
佐劑依主要的作用機制，可以概略分為2大類：免疫調節劑與疫苗遞送系統。免疫調節劑的主要作用，在於刺激免疫細胞的類鐸受體（toll-like receptor, TLR），進而調節疫苗的免疫效果；疫苗遞送系統則能讓適量的疫苗進入體內並維持一定的釋放時間。免疫調節劑雖然能有效誘導免疫反應，但目前多處於研發階段。針對全面性施打的疫苗所設計的佐劑，以添加疫苗遞送系統為主，有些已經進入臨床試驗階段，有些則已經核准使用於人體。以季節流感疫苗為例，Fluad與Inflexal V即添加了乳狀液或仿病毒顆粒加強免疫效果，這些疫苗在歐洲已經核准使用於人體。

佐劑的開發，除了必須了解候選佐劑的物理、化學性質與免疫誘導能力之外，尚須釐清該佐劑的免疫作用機制、體內動力模式以及其對於生物體的安全問題。目前只有鋁鹽經由美國食品及藥物管理局（FDA）核可，能使用於全面性施打的疫苗。鋁鹽是氫氧化鋁與磷酸鋁等無機鹽類的通稱，作為佐劑已經有80年的歷史，但是作用機制仍然眾說紛紜，廣為接受的機制是鋁鹽能夠吸附與逐步釋放抗原（疫苗），近期亦有研究指出，鋁鹽能夠刺激免疫細胞（包括樹突細胞與巨噬細胞），具有免疫調節性質。鋁鹽具有生物安全性，對於類毒素疫苗（例如白喉與破傷風）的免疫增強也有不錯的成效。然而，在H5N1禽流感疫苗的小鼠實驗與初步人體臨床測試的結果顯示，添加鋁鹽佐劑的H5N1流感疫苗，需接種2次以上才能誘導出有效的免疫力。

就在鋁鹽發展的同時，科學界發現有些油脂（例如礦物油）也能夠促進免疫反應。為了使得免疫細胞能夠有效吞噬這些油脂，必須添加乳化劑或介面活性劑來降低油與水之間的表面能量，使之形成均勻的乳狀液。油包水型式的乳化液，能夠藉由油層的包覆，達到保護抗原的效果；然而調配此類型乳化液必須使用大量的油脂，副作用太大，不宜使用於全面性施打的流感疫苗。諾華（Novartis）所開發的佐劑MF59與葛蘭素史克（GSK）的AS03，皆為水包油型式的乳狀液，許多研究報告證明其在人用疫苗使用安全，且有免疫增強效果，但其免疫誘導之作用機制，目前尚不明確。


初步的研究顯示水包油的乳狀液主要能增進抗原對於免疫細胞的呈現，其中MF59使用單階段的乳化程序，利用親水性乳化劑Tween 80與疏水性乳化劑Span 85，將少量的角鯊烯（squalene）與候選疫苗在高速高壓環境下均質成為乳狀懸滴，使用濾膜過濾之後成為約200奈米的高流動性乳狀液；另一方面，AS03則使用Tween 80，先將生理緩衝溶液、角鯊烯與維生素E混合油劑均質成為黏稠狀乳狀液，於接種時再將乳狀原液稀釋分散於候選疫苗當中，使疫苗成為高流動性的乳狀液。許多文獻指出，添加MF59與AS03於高病原性的H5N1禽流感候選疫苗亦能增強該疫苗之免疫效力，歐盟也已核准由諾華所開發添加MF59佐劑的H5N1流感疫苗以及由葛蘭素史克所開發添加AS03佐劑的H5N1流感疫苗在緊急疫情發生時銷售。根據2009年9月份新英格蘭醫學雜誌的研究報告，候選H1N1流感疫苗若能搭配MF59佐劑，即使施打單劑量且低劑量之候選疫苗亦足以對抗新型H1N1流感病毒，可有效紓緩供應短缺憂慮。

新型乳化佐劑的設計概念
本院疫苗研發中心（以下簡稱疫苗中心）完成疫苗研發cGMP設施與P2+緊急製造區建置之後，開始以細胞培養方式進行H5N1流感疫苗研發，並於2009年8 月取得衛生署核准，於11月25日開始與台大醫院共同合作執行H5N1新型流感疫苗第一期人體臨床試驗。隨著H1N1新流感疫情持續蔓延，疫苗中心在2009年6 月取得H1N1新型流感病毒的種株，立刻投入量產工作。為了達成衛生署所指示的生產緊急備用H1N1疫苗，採取2種策略並行的方式進行疫苗生產。

第一種策略是運用微載體培養細胞來量產新型流感疫苗，預期可以增加去活化病毒抗原之產能。由於此為因應緊急突發疫情，製備供臨床試驗用之疫苗，其搭配使用的佐劑必須為FDA已確定安全無虞的鋁鹽佐劑，其相關的安全性測試亦需符合醫藥品查驗中心之規範。第二種策略是研發新型之疫苗佐劑，預期可以藉由免疫效力的提升來達到節約抗原使用的目標。經由本院疫苗中心研究團隊所設計開發的新型乳化佐劑PELC，其油劑的組成比例與MF59類似，其主要差異在於PELC親水性乳化劑改良自FDA已核可使用於人體且同時具有親疏水團聯的生物可吸收式高分子，以取代毒性相對較強的Tween 80。PELC親水端部份為水溶性聚乙二醇PEG，疏水端部份則選用生物降解性材料聚乳酸己內酯PLC。

乳化劑的親疏水性質，可以藉由所組成親水與疏水團聯之分子量加以控制，乳化劑於進入生物體內之後將開始進行水解，所產生的副產物乳酸和己醇酸都可以透過體內的克氏循環（Krebs cycle）轉化成對人體無傷害性的二氧化碳和水，連同水解產物聚乙二醇一同排出體外。由此可知，佐劑的組成安全性較高，植入人體之後能由體內所分解代謝，使用時較不會有疑慮。在製造程序方面，添加PELC之乳化劑型疫苗使用方法與AS03相同，是經由乳化-分散兩階段程序所製成，為奈米等級的水包油-油包水複合相乳化液（如圖一所示）。


兩階段程序的優點，在於使用時的活動度（degree of freedom）較大，對於研發階段中的新型佐劑製程的各項參數都能逐一確定。在評估具有同樣成分的PELC乳化製劑疫苗時，若將去活化病毒於第一階段乳化程序時加入，則可視為抗原包覆方法負載；若將去活化病毒於第二階段分散程序時加入，則成為表面吸附去活化病毒疫苗。前者的優點在於能達到有效包覆疫苗抗原之目的，後者的優點在於能避免疫苗抗原於乳化過程當中直接受到均質機剪力（shear force）的衝擊。從物理化學性質分析結果得知，本院所發展的PELC乳化製劑疫苗具有良好的穩定度、流動性與疫苗控制釋放能力。為因應緊急的新型流感突發疫情，本院疫苗研發團隊設計並進行了肌肉單劑量去活化病毒疫苗小鼠免疫實驗，用以評估所選定的候選流感疫苗效力。研究結果初步證實，H5N1去活化病毒能佐以PELC乳化劑型佐劑，其所產生的小鼠免疫能力，更優於提升10倍抗原含量所能誘導之免疫效果（圖二），顯示PELC佐劑在單劑量流感疫苗開發上扮演了重要角色。此外，由研究團隊在樹突細胞活化機轉的研究結果顯示，新型乳化佐劑PELC之作用為遞送疫苗，而非免疫調節。



佐劑的開發能夠讓現有的疫苗效力更強，也能讓過去遭遇瓶頸的疫苗成為可能。MF59與AS03乳狀液是目前最具有開發潛力的疫苗佐劑，然而在使用上仍有其副作用。事實上，MF59與AS03所選用的核心油脂角鯊烯，長久以來即有引起慢性發炎以及自身免疫破壞性疾病的疑慮，例如波灣戰爭綜合病徵（Gulf War Syndrome, GWS），致使美國FDA至今遲遲未核准含有角鯊烯成分的疫苗上市；此外，這些疫苗所選用的乳化劑Span 85與Tween 80，以及由本院疫苗研究團隊開發的PELC所採用的生物可吸收式高分子，雖然俱備安全性高的特性，且已被長久使用於食品、化妝品或作為體內注射使用，但是此類型乳化劑皆屬於非離子型界面活性劑，無法有效刺激免疫細胞。因此，經由製備而得的MF59、AS03或PELC均屬於疫苗遞送系統，雖然可以利用其抗原控制釋放的能力來增強由病毒抗原所誘導引發的適應性免疫反應，達到對抗該病毒的效果，卻因為缺乏免疫調節功能，無法達到交叉保護的效果。

面對千變萬化的流感病毒侵襲，除了針對每年可能流行的病毒株製成疫苗，將來若能在候選疫苗當中加入足以啟動先天免疫反應的免疫調節劑，即可從免疫反應的源頭開始做起，進而達到對新、舊流感病毒產生交叉保護的效果，從而根本解決流感威脅。為了以交叉保護效果為目標，本院疫苗研發團隊未來研究所研擬的方法有二：其一是安排於去活化病毒疫苗當中，添加各病毒株組成成分相對穩定且相類似的次單元蛋白，以增加抗原的廣度；其二是從核心油脂的選擇以及乳化劑的開發著手。在核心油脂的選擇方面，研發團隊計畫選用角鲨烷（squalane）。角鲨烷為人體皮脂線的主要成份，比角鯊烯具有更佳的抗氧化能力。其次，為確保未來候選疫苗之臨床功效，新型佐劑必須能刺激樹突細胞之類鐸受體，才能得到最完善的免疫效果。預計未來以PELC搭配免疫調節劑（例如CpG或短鏈胜肽），調和佐劑的控制釋放效果與免疫調節能力，將能成為新一代疫苗佐劑。

佐劑製造技術的發展，除了能縮短準備疫苗的時間，還能以較少的抗原得到更完善的免疫效果，有助於安定民心。不過佐劑從研發到上市，還有很長的路要走。在初步完成佐劑之細胞篩選與免疫評估後，研究團隊預計將以合作方式完成毒性與安全性測試、免疫作用機制與動力學研究，再結合臨床測試，逐步累積各項人體實驗數據，最後更需要政府或國際藥廠的協助，才能完成產品化之後續研究。
《文/圖：疫苗研發中心黃明熙博士》